Глюкозаминилмурамилпептиды: на пути к пониманию молекулярного механизма биологической активности

Дата публикации: 24.04.1998

928

Автор: В.А. Несмеянов
Издание: International Journal on Immunarehabilitation, № 10
Год: 1998

Аннотация: Глюкозаминилмурамилпептиды – путь к пониманию молекулярного механизма биологической активности

Ключевые слова: гмдп, т-хелпер, макрофаги, мурамилпептид

Глюкозаминилмурамоилпептиды: на пути к пониманию молекулярного механизма биологической активности

В.А. Несмеянов

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Мурамоилпептиды (МП)¹ — класс соединений, открытый в 70-х годах французскими учеными во главе с Э. Ледерером в результате поиска минимального иммуноактивного фрагмента клеточных стенок микобактерий, входящих в состав полного адъюванта Фрейнда [15]. Этим минимальным фрагментом, способным заменить целые микобактерии в полном адъюванте Фрейнда, оказался фрагмент пептидогликана клеточной стенки муреина-N-ацетилмурамоил-аланил-D-изоглутамин (мурамоилдипептид, МДП).

Исследование свойств полученного синтетическим путем МДП [22] продемонстрировало, что помимо адъювантной активности для него характерны способность стимулировать неспецифическую резистентность организма к бактериальным и вирусным инфекциям, а также пирогенный и сомногенный эффекты [25]. Таким образом, МДП влиял как на неспецифические иммунные реакции, так и на адаптивный иммунитет.

В последующие два десятилетия в различных лабораториях мира были синтезированы сотни аналогов и производных МДП, причем некоторые обладали еще и противоопухолевой активностью [25]. Среди этих соединений были и МП, углеводная часть которых содержала дисахаридный фрагмент GlcNAcβ1--4-MurNAc [9]. Этот фрагмент является минимальным повторяющихся фрагментом полисахаридной цепи муреина, и содержащие его гликопептиды выщепляются из клеточной стенки бактерий в результате ферментативного гидролиза и поступают в кровоток, причем это может иметь место не только при инфицировании организма, но и в норме при деградации бактерий, населяющих желудочно- кишечный тракт [49]. Данный факт позволил Э. Ледереру выдвинуть гипотезу о том, что МП являются «витаминами» иммунной системы, не синтезируемыми самим организмом, но за счет поступления извне поддерживающими иммунный статус. Свидетельством попадания в организм олигосахарид-содержащих МП было обнаружение Пинегиным с соавторами [33] в крови здоровых доноров - антител к N-ацетилглюкозаминил-β1--4-М-ацетилмурамоил-аланил--изоглутамину (ГМДП), но не к МДП.

Несмотря на успехи в исследовании биологических свойств МП и в их практическом применении, молекулярный механизм активности МП долгое время оставался малоизученными

__________________________________________________________________________

¹Список сокращений: МП — мурамоилпептиды; ГМП — глюкозамниклмурамоилпептиды; МДП — М-ацетилмурамоил-β1--4-аланил-D-изоглутамин; ГМДП — N-ацетилглюкозаминил-β1--4-N-ацетилмурамоил-аланил-D-изоглутамин; L-ГМДП — N-ацетилглюкозаминил-β1-4-N-ацетилмурамоил-аланил-L-нзоглутамин; ГМДП-Lуs — N-ацетилглюкозаминил-β1--4-N-ацетнлмурамоил-аланил-D-изоглутаминил-лизин; МТП-ФЭ — мурамоилтрипсотидфосфатндилэтаноламин; ОАА — опухолеассоциированныеантигены; АГКГ — антигены главного комплекса гистосовместимости.

В течение ряда лет спорным было наличие мембранных рецепторов МП на макрофагах [26, 46], противоречивыми до настоящего времени остаются данные и о типах клеток, способных отвечать на МП. Лишь в последнее десятилетие появился ряд работ, свидетельствующих о рецепторном механизме действия МП н о наличии у клеток разной природы мембранных и внутриклеточных центров связывания МП. Целью настоящей публикации является рассмотрение вопроса о молекулярных основах адъювантной и противоопухолевой активностей МП, прежде всего ГМП.

Молекулярные основы адъювантного действия

Адъювантный эффект МП, в том числе ГМП, хорошо документирован [9, 25]. Он проявляется при введении антигена с МП как в масляной эмульсии, так и в солевом растворе. Считается, что основой адъювантного действия МП является активация макрофагов, приводящая к индукции биосинтеза цитокинов. Так для МДП и его аналогов было продемонстрировано [10,27] индуцирующее влияние на секрецию интерлейкина 1 (IL1), интерлейкина 6 (IL6) и фактора некроза опухолей α (TNF- α). Аналогичные данные получены и для ГМП [6]. Эти цитокины не только вызывают активацию клеток миелоидного ряда, но и влияют на адаптивный иммунитет, в том числе путем активации биосинтеза лимфоцитарных цитокинов. Тем не менее данный эффект не исключал вклад других факторов в адъювантную активность МП. В связи с тем, что клетки макрофагального ряда на ранних стадиях распознавания антигенов участвуют в их презентации Т-хелперам, можно было предположить, что МП вносят вклад в этот процесс. Основную роль в презентации играют антигены главного комплекса гистосовместимости (АГКГ) II класса (у мышей Iа-антигены) на антиген-презентирующих клетках, причем показано, что их экспрессия модулируется цитокинами, и эта модуляция влияет на антиген-презентирующую активность клеток [38]. Для МП подобные данные в литературе отсутствовали, более того Behbehani с соавторами не удалось обнаружить усиления экспрессии Iа-антигенов под действием МДП [11].

Напротив, наши данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии при окрашивании моноклональными антителами против Iа-антигенов макрофагов мыши, обработанных ГМДП in vitro или in vivo, свидетельствовали о росте числа Ia-позитивных клеток и об увеличении поверхностной плотности этих антигенов [5, 31]. Эффект не зависел от гаплотипа мышей, т.е. не был генетически детерминирован: усиление Iа-экспрессии наблюдалось и для мышей BALB/c (H-2d), и для C57BL/6 (Н-2к). Модулирующему влиянию ГМДП были подвержены и АГКГ II класса моноцитов человека, хотя амплитуда ответа была ниже, чем у мышей.

Как в случае макрофагов перитонеального экссудата мышей, так и в случае макрофагов селезенки далеко не все клетки отвечали на ГМДП увеличением Iа-экспрессии [5, 31]. По всей видимости, наличие эффекта зависело от стадии дифференцировки клетки.

При работе с макрофагами, выделенными из органов животных и человека, трудно исключить возможность индукции Iа-антигенов опосредовано, в результате действия ГМДП на Т-лимфоциты и секреции последними цитокинов. Поэтому результаты, полученные с перитонеальными и селезеночными макрофагами, были подтверждены опытами с мышиной миеломоноцитарной линией клеток WEHI-3. Как и у макрофагов, в популяции клеток WEHI-3 при инкубации с ГМДП наблюдался рост числа Iа-позитивных клеток [31]. Дополнительным аргументом против непрямого действия ГМДП являлась неспособность циклоспорина A (CsA), блокирующего секрецию ряда цитокинов Т-лимфоцитами [18], влиять на индуцируемую ГМДП экспрессию Iа-антигенов [21].

Исследование аналогов ГМДП на способность вызывать экспрессию Iа-антигенов показало, что данный эффект коррелирует с наличием у ГМП адъювантной активности (таблица 1). МДП также проявлял способность повышать экспрессию Iа-антигенов, хотя и в меньшей степени, чем ГМДП, что коррелировало с его более низкой адъювантной активностью [9]. Расхождение наших результатов с данными Behbehani с соавт. [11], не обнаружившими Ia-индуцирующей активности МДП, можно объяснить колоколообразным характером зависимости доза-эффект: использованные Behbehani концентрации МДП (10-300 мкг/мл) были значительно выше оптимальной (0,1 мкг/мл), то есть находились в области ингибирования эффекта. Колоколообразный характер дозовой зависимости индукции Iа- антигенов был характерен и для других МП.

Таким образом, вызываемое биологически активными ГМП усиление экспрессии Iа-антигенов на макрофагах вносит свой вклад в их адъювантную активность, причем экспрессия Iа-антигенов обусловливается непосредственным действием на макрофаги ГМДП, а не опосредована Т-клеточными цитокинами.

В последнее время было обнаружено, что МДП и некоторые его адъювантно-активные аналоги способны индуцировать экспрессию Iа-антигенов на мышиных В-лимфоцитах [12].

Антиген-презентирующая активность клеток миеломоноцитарного ряда под влиянием МП может усиливаться и в результате повышения экспрессии молекул адгезии, поскольку эти молекулы вовлечены во взаимодействие с контррецепторами Т-хелперов. Индуцирующее влияние МДП, мураметида и мурабутида на экспрессию CD11 a,b,c/CD18 и ICAM-1 (CD54) антигенов моноцитами человека было продемонстрировано Darcissac с соавт. [13]. Эти же антигены на лимфоцитах не были подвержены модуляции. Сходные результаты о модуляции экспрессии на человеческих моноцитах антигена ICAM-1 и некоторых субъединиц интегринов (αL, α5, β1) аналогом МДП- мурамилтрипептидфосфатидил-этаноламином (МТП-ФЭ), были опубликованы Asano с соавт. [10]. Авторы полагают, что эффект может быть опосредован цитокинами (IL1, TNF-α), секретируемыми моноцитами под действием МТП-ФЭ.

В отличие от макрофагальных молекул адгезии экспрессия тех же антигенов на лимфоцитах человека не была подвержена влиянию МДП, мураметида и мурабутида [13].

Таблица 1. Влияние глюкозаминилмурамоилпептидов на экспрессию Iа-антигенов перитонеальными макрофагами мыши

Глюкозаминилмурамоилпептид	Наличие адъювантной активности	Увеличение числа Ia-позитивных клеток (%)
Глюкозаминилмурамоилпептид	Наличие адъювантной активности	1 м кг/мл	10 мкг/мл
ГМДП	+	18,0	25,2
L-ГМДП	-	2,7	2,6
(ГМДП),	+	14.3	19.6
ГМДП(ОВи) .	+	13,4	7,3
ГМДП-СООН	+	23.9	28,5
ГМДП-Lys	+	14.8	16,6
ГМДП-Lys-St	+	23,5	25,7
GlcNAcβ1--4-MurNAc	-	3.0	1,1

L-ГМДП — GlcNAcβ1--4-MurNAc-Ala-iGln; ГМДП-Lys — GlcNAcβ1-4-MurNAc-Ala-D-iGln-Lys; (ГМДП)₂ — GlcNAcβ1--4-MurNAc-(Ala-D-iGln) — GlcNAcβ1--4-MurNAc-(AIa-D-iGln), ГМДП(ОВu) — GlcNAcβ1--4-MurNAc-Ala-D-iGln(γ-бутиловый эфир); ГМДП-СООН — GlcNAcβ1--4-MurNAc-Ala-D-Glu; ГМДП-Lys-St — GlcNAcβ1--4-MurNAc-Ala-D-iGln-(↋-N-стеароил)лизин.

Молекулярные основы противоопухолевого действия

На экспериментальных опухолях мышей было показано, что ГМДП способен вызывать не только замедлению роста, но и некроз хорошо развитых опухолей, в частности, саркомы S-180 и меланомы В-16 [7]. Этот эффект был приписан иммуномодулирующему действию ГМДП, то есть активации цитотоксических клеток, поскольку известно, что МП способны in vitro индуцировать Цитотоксичность моноцитов/макрофагов [6, 38]. Свой вклад в противоопухолевый эффект могла вносить н способность ГМДП усиливать созревание и выход в кровоток лейкоцитов [8], активность, характерная и для некоторых производных МДП [52].

В то же время полученные нами данные о способности ГМП индуцировать экспрессию поверхностных антигенов у макрофагов позволили нам предположить, что модулирующему влиянию ГМП могут быть подвержены и антигены опухолевых клеток, существенные для распознавания этих клеток иммунной системой. К числу таких молекул относятся опухолеассоциированные антигены (ОАА), антигены главного комплекса гистосовместимости и молекулы адгезии.

Результаты исследования ГМДП-индуцированной экспрессии ОАА, полученные для четырех линий опухолевых клеток человека разной природы, а именно: меланомы BRO, аденокарциномы легкого А-549, карцином толстой кишки WIDR и молочной железы МаТu, - имели сходный характер. Инкубация in vitro опухолевых клеток с ГМДП вызывала дозозависимое изменение как числа ОАА-несущих клеток, так и средней плотности антигенов на клеточной поверхности [2, 47]. Дозовая зависимость носила колоколообразный характер, характерный и для других эффектов ГМП, причем максимум экспрессии для разных линий вызывался различными концентрациями ГМДП. Различалась и амплитуда ответа

Не только ГМДП, но и его биологически активные аналоги способны модулировать экспрессию ОАА. Так эксперименты с клетками рака молочной железы продемонстрировали, что ГМДП-лизин более эффективен, чем ГМДП, в индукции ОАА ВСА-2, причем в концентрации, на порядок более низкой (таблица 2). Еще более активным оказалось липофильное производное ГМДП-стеароиллизин (ГМДП-Lys-St). В то же время биологически неактивный L-ГМДП не влиял на экспрессию ВСА-2 антигена [47]. Аналогичные результаты, говорящие о большей ОАА- индуцирующей активности названных аналогов ГМДП, были получены и для меланомы BRO. Известно, что липофильные МП, в том числе, МДП-Lys-St, проявляют высокую противоопухолевую активность [25, 53]. Таким образом, повышенная активность ГМДП-Lys-St в индукции ОАА коррелирует с противоопухолевым эффектом липофильных МП, косвенно свидетельствуя в пользу предположения о том, что ОАА-индуцирующий эффект может вносить свой вклад в противоопухолевый эффект ГМП.

Таблица 2. Влияние некоторых ГМП на экспрессию антигена, ассоциированного с карциномой молочной железы

ГМП	Концентрация, мкг/мл
ГМП	0.001	0,01	0.1	1	10	50
ГМДП	22 (68,3)	24 (71,8)	28 (75,5)	32 (79,0)	27 (74,3)	23 (69,4)
L-ГМДП	21 (65,2)	22 (65,4)	22(65,1)	21 (64,9)	20 (65,6)	22 (65,4)
ГМДП-Lys	25 (73,6)	30 (75,1)	39 (81,2)	32 (79,2)	27 (73,9)	26 (73,4)
ГМДП-Lys-St	37 (79,4)	46 (85,5)	39 (80,9)	34 (80,2)	32 (78,8)	30(74,9)

В таблице указан процент ВСЛ-2-позитнвных клеток. В скобках - средняя интенсивность флуоресценции.

Прямым доказательством вклада индуцированной ГМДП модуляции спектра поверхностных антигенов опухолевых клеток в их распознавание иммунной системой послужили полученные нами данные о том, что обработанные ГМДП клетки меланомы BRO были в большей степени подвержены лизису периферическими мононуклеарными клетками крови, чем необработанные меланомные клетки [47].

Характер действия ГМДП-лизина и ГМДП-Lys-St отличался от действия ГМДП не только по амплитуде, но и по кинетике: если для ГМДП было характерно начальное падение уровня экспрессии ОАА, для аналогов подобного эффекта не наблюдалось [47]. Этот факт указывает на то, что молекулярные механизмы действия гидрофильных и липофильных мурамоилпептидов могут быть различны. Об этом же говорят опубликованные Schreck с соавт. [37] данные о том, что МДП, но не липофильный MurNAc-Thr-D-iGln-Sn-дипальмитоил-глицерин активирует NF-kB транскрипционный фактор.

Как и в случае Iа-антигенов, в ответ на ГМДП вовлекалась лишь часть клеточной популяции. Процент отвечающих клеток существенно повышался при дополнительном введении ГМДП через 24-48 часов. Например, для аденокарциномы легкого А-549 число клеток, ставших КЭА-положительными, увеличивалось с 30% (однократное введение) до 45%, для MUC-18 антигена меланомы BRO - с 13% до 29%. Третье добавление ГМДП делало эту цифру еще выше. Таким образом, сам ГМДП оказывал праймирующий эффект на неотвечающие опухолевые клетки [47]. Исследование механизма этого явления показало, что праймирующим агентом служит TNF-α, секретируемый опухолевыми клетками при действии ГМДП [48]. Подобное синергическое действие ГМДП и TNF-α может объяснить тот факт, что некроз-индуцирующий эффект ГМДП проявляется лишь в отношении хорошо развитых опухолей [7], поскольку лишь на поздних стадиях опухолевого роста секретируется количество TNF-α, достаточное для праймирования опухолевых клеток.

Помимо индукции ОАА, ГМДП влиял на экспрессию опухолевыми клетками АГКГ класса и молекул ICAM, однако для этих групп антигенов наличие/отсутствие эффекта зависело от природы и стадии дифференцировки клеток, а также типа антигена. Так модулирующее действие ГМДП в отношении антигенов HLA-DR и HLA-ABC проявлялось только для клеток аденокарциномы легкого А-549 [47]. Среди молекул семейства ICAM экспрессия ICAM-1 (CD54) на высокометастазирующей сублинии меланомы BRO, где он исходно отсутствовал, не индуцировалась ГМДП, в то время как на низкометастазирующей сублинии, изначально экспрессирующей ICAM-1, она усиливалась [1]. Напротив, экспрессия ICAM-3 (CD50) модулировалась лишь на высокометастазирующей сублинии.

Таким образом, ГМДП обладает избирательным действием в отношении регуляции экспрессии различных антигенов поверхности опухолевых клеток, причем характер влияния определяется как типом антигена, так и характеристиками клетки-мишени.

Центры связывания ГМП на клетках-мишенях

Несмотря на то, что наличие даже на макрофагах центров связывания МП долгое время являлось предметом дискуссии [26,46], рецепторный механизм действия МП выглядел наиболее реальным ввиду стереоспецифичности эффектов, а также насыщаемого характера зависимости доза-ответ [24,44]. Для решения вопроса о наличии на клетках разной этиологии центров связывания ГМП нами были применены методы проточной цитофлуориметрии и радиолигандного анализа с использованием флуоресцеин- и иод- 125-меченных производных ГМДП, полученных конъюгацией лизинсодержащего аналога ГМДП (ГМДП-Lys) соответственно с флуоресцеини-зотиоцианатом и реагентом Болтона-Хантера.

Поиск мембранных рецепторов ГМП на перитонеальных макрофагах мыши радиолигандным анализом выявил несколько сотен специфических участков связывания с Kd 350 пМ [17]. Эти данные совпадают с данными Silverman с соавторами [39] о рецепторах МДП на неактивированных мышиных макрофагах, выявившими с помощью лизинового аналога МДП, меченного реагентом Болтона-Хантера, мембранные рецепторы с Kd около 400 пМ. Для исключения эндоцитоза радиолигандный анализ проводился при 4°С в течение нескольких минут. Ввиду высокого уровня неспецифического связывания клетками меченых производных МП во всех случаях проводился ингибиторный анализ, и при оценке числа участков связывания специфическое связывание определяли как разность между связыванием зонда в отсутствие и в присутствии немеченого ГМДП.

Впоследствии выводы о мембранной локализации обнаруженных радиолигандным анализом рецепторов были подвергнуты сомнению Richerson с соавторами [36], которые, с одной стороны, показали, что быстрый эндоцитоз ФИТЦ-меченного МДП-Lys альвеолярными макрофагами кролика имеет место и на холоду, с другой — не обнаружили мембранной флуоресценции клеток. Тем не менее, едва ли эти данные могут отрицать наличие мембранных рецепторов. Нам также не удалось обнаружить с помощью ГМДП-Lys-ФИТЦ мембранных участков связывания, но это объяснялось недостаточной чувствительностью метода проточной цитофлуориметрии, что, очевидно, имело место и в работе Richerson с соавторами. Что касается быстрого эндоцитоза, то либо он не происходил ввиду отличия свойств перитонеальных макрофагов мыши от альвеолярных клеток кролика, либо не сказывался на результатах, поскольку проводился ингибиторный анализ, и специфическое связывание имело насыщающий характер, причем насыщение достигалось в течение нескольких минут [17, 39].

Использованный нами и Silverman с соавторами [39] метод радиолигандного анализа давал усредненное значение числа центров связывания МП на клетку, поэтому было не исключено существование популяций макрофагов, одни из которых не несли рецепторов вообще, а другие, напротив, имели значительное число центров связывания. Против подобного варианта свидетельствовали данные проточной цитофлуориметрии, не выявившей клеток, несущих на поверхности рецептор ГМДП. Принимая во внимание, что данным методом анализировались отдельные клетки и что чувствительность этого метода составляла 1000 молекул флуоресцеина на частицу, можно утверждать, что значительного различия между отдельно взятыми макрофагами в плотности рецепторов МП нет.

Значительно большее число центров связывания ГМДП было обнаружено внутри макрофагов мыши после перфорирования клеточной мембраны (таблица 3), причем расчет по методу Скэтчарда выявил два типа сайтов, различающихся по Kd (21 и 540 нМ). Число первых было на порядок меньше, чем вторых [42]. Наличие внутриклеточных МДП-связывающих белков крысиных макрофагов было продемонстрировано Tenu с соавторами [45] с использованием метода фотоаффинной модификации.

Наличие у макрофагов как мембранных, так и внутриклеточных центров связывания МП оставляло открытым вопрос, какие же из них отвечают за проведение сигнала, то есть являются функционально значимыми. На функциональную активность внутриклеточных центров указывали:

данные ингибиторного анализа, выявившего корреляцию между наличием биологической активности МП и способностью ингибировать взаимодействие ГМДП с внутренними рецепторами: ни фрагменты ГМДП, ни L-ГМДП не ингибировали связывание, в то время как биологически активные МП, в том числе МДП, вызывали ингибирование;
результаты использования конъюгатов МДП с белками [43] и неогликопротеинами [32], продемонстрировавшие усиление активности МДП при повышении эффективности доставки его внутрь макрофагов за счет эндоцитоза, обусловленного лектиновыми рецепторами, а также повышение активности конъюгата МДП с поли-D,L-аланин-L-лизином при введении его с анти-МДП антителами, обусловленное взаимодействием образующегося комплекса антиген-антитело с Fc-рецептором макрофагов [26];
эксперименты с МДП, инкапсулированным в липосомы [16] или нанокапсупы [28], показавшие, что активация макрофагов мыши и моноцитов человека не требует вовлечения мембранных рецепторов.

Таблица 3. Локализация центров связывания ГМДП у клеток различной природы

Клетки и клеточные линии	Число специфических участков* связываний*
	внутренних	внешних
Перитонеальные макрофаги мыши	98000±5900	900**
WEH1-3 (миелолейкоз мыши)	30350±1760	<1000
Jurkat (Т-лейкоз человека)	40700±2440	<1000
EL4 (тимома мыши)	22300± 1100	<1000
RLS (Т-лимфосаркома крысы)	32800±1640	<1000
РАI (миелома мыши)	<1000	<1000
SP2/0 (миелома мыши)	<1000	<1000
IMR-32 (нейробластома человека)	75000±7800	<1000
BRO (меланома человека)	14000±800	<1000

*Определено методом проточной цитофлуориметрии с использованием ФИТЦ-производного ГМДП-Lys.

**Определено методом радиолигандного анализа с использованием ГМДП-Lys, меченного реагентом Болтона-Хантера.

Опыты, выполненные нами, продемонстрировали, что инкапсулированный в липосомы ГМДП также гораздо более эффективно индуцирует Iа- антигены на макрофагах мыши, чем ГМДП в растворе [21]. Поскольку липосомальный ГМДП попадал в клетку, минуя внешние рецепторы, что было подтверждено соответствующими контролями, функциональная значимость внутриклеточных участков связывания не вызывает сомнений. В то же время остается открытым вопрос о возможности проведения сигнала через внешние высокоаффинные рецепторы МП. Их Kd существенно ниже, чем действующие концентрации МП (0,1-1 μМ), поэтому предпочтительнее выглядят внутриклеточные мишени, однако нельзя исключить, что действие МП опосредуется сигналами, поступающими с разных рецепторов, в том числе и высокоаффинных мембранных. Следует отметить, что на мембране макрофагов имеются и низкоаффинные рецепторы (см. ниже), которые трудно обнаружить радиолигандным анализом ввиду быстрого распада комплекса МП-рецептор.

Для оценки наличия центров связывания клеток различной природы, являющихся, судя по биологической активности ГМДП, его потенциальными мишенями, был проанализирован ряд клеточных линий [42]. Результаты анализа приведены в таблице 3.

Ни в одном случае с помощью флуоресцентной метки не было обнаружено поверхностных рецепторов ГМДП, в то время как внутренние центры связывания были найдены у трансформированных Т-хелперов (Jurkat, RLS), тимомы EL-4 и миеломоноцитарных клеток WEHI-3, но не у клеток мышиной плазмацитомы (РАI, SP2/0) Значительное число внутриклеточных центров связывания ГМДП присутствовало в клетках нейробластомы человека IMR-32. Этот результат и удивителен, если принять во внимание известно действие мурамилпептидов на центральную нервную систему, а также тот факт, что рецепторы ГМДП были обнаружены Цетлиным с соавторами [20] на мембранах мозга крысы.

Наличие внутриклеточных центров связывания ГМДП у нормальных Т-хелперов, но не у В-лимфоцитов было продемонстрировано для клеток селезенки мышей BALB/c двухпараметрическим цитофлуориметрическим анализом с использованием ГМДП-Lys-FluTC и меченных фикоэритрином моноклональных антител (МА) к СD4-маркеру Т-хелперов или антител к IgM рецептору В-клеток [42].

Таким образом, не только макрофаги, но и другие типы клеток, в частности, Т-хелперы, являются потенциальными мишенями ГМДП. По всей видимости, способность клеток, имеющих внутриклеточные рецепторы, отвечать на МП определяется не только наличием рецепторов, но и способностью мурамоилпептида проникать внутрь клетки-мишени. В случае клеток макрофагального ряда, для которых характерен активный эндоцитоз, проникновение ГМП внутрь клетки не вызывает затруднений. В случае же других потенциальных мишеней, например, Т-хелперов, возможность поглощения ГМП может определяться функциональным состоянием клетки, что в свою очередь может объяснять противоречивые данные о действии МП на Т-клетки [25].

Молекулярная характеристика рецепторных молекул

Для характеристики МП-связывающих молекул нами применялся метод фотоаффинной модификации с использованием иод-125-меченного азидосалицилового производного ГМДП-Lys-ГМДП-Lys[(125I)AzS]. Анализ связавших метку белков интактных или перфорированных дигитонином перитонеальных макрофагов мыши осуществляли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). В связи с значительным уровнем неспецифического связывания проводился ингибиторный анализ с использованием немеченого ГМДП.

Мечение интактных макрофагов мыши не выявило ГМДП-связывающих белков, очевидно ввиду малого числа мембранных рецепторов. В то же время у перфорированных клеток был обнаружен ряд меченых белков, лишь некоторые из которых, а именно, белки с молекулярными массами 31-34 кД и 36-39 кД, связывали радиоактивный лиганд специфически, только за счет мурамоилпептидного фрагмента [17, 30]. Связывание лиганда с белками с молекулярной массой 42-47 кД ингибировалось ГМДП лишь частично, но, однако полностью ингибировалось конъюгатом ГМДП-LysIAzS], что предполагало участие в связывании азидосалицилатной группировки.

Аналогичный подход с использованием двух радиоактивно-меченных фотоактивируемых лигандов, а именно, азидосалицилового производного МДП-Lys и МДП-Рhе-125INз, был применен Tenu с соавторами [36] для обнаружения МДП-связывающих молекул у альвеолярных макрофагов крысы. Как и в наших экспериментах на интактных макрофагах, рецепторных молекул выявлено не было. После перфорирования клеток меченным оказался белок с молекулярной массой 40-45 кД, очевидно, идентичный обнаруженному нами белку 42-47 кД. Сходство подчеркивалось тем фактом, что для ингибирования связывания МДП-Рhе-125INз с белком 40-45 кД требовалось в 20 раз больше МДП, чем МДП-Рhе-INз, то есть заместитель вносил существенный вклад во взаимодействие лиганд-рецептор.

В дальнейшем для детекции ГМДП-связывающих белков нами был применен полимерный зонд (ГМДП-Lys)-ПАA-(Bi), представляющий собой смешанный конъюгат ГМДП-Lys и биотина с полиакриламидом с молекулярной массой 30-40 кД. (ГМДП-Lys)-ПАA-(Bi) содержал 20 мольных процентов ГМДП-Lys и 5 мольных процентов биотина Удобство подобного зонда заключалось в возможности визуализации его конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена и субстратом пероксидазы.

Использование данного зонда позволило выявить после SDS-PAGE и вестерн-блоттинга в макрофагах мыши белки с молекулярными массами 32 кД и 34 кД, сохраняющие способность специфически связывать ГМДП [3, 30]. Очевидно, эти белки были идентичны белкам 31-34 кД, выявленным с помощью аффинного мечения. Специфичность связывания подтверждалась тем фактом, что для сорбции необходима была интактная молекула гликопептида: присутствие углеводного фрагмента ГМДП-дисахарида GlcNAc-MurNAc, и дипептида Ala-D-iGln не отменяло связывание. Аналогичные белки были обнаружены в миеломоноцитарной линии клеток WEHI-3, макрофагах крысы, Т-клеточной крысиной лимфосаркомы и человеческой Т-клеточной линии Jurkat [29]. Таким образом, данные белки были общими для клеток разной природы и разных видов. Помимо названных белков способностью специфически связывать полимерный зонд обладал белок 16-20 кД

Наличие МДП-связывзющих белков на лимфоцитах было продемонстрировано Tenu с соавторами [45] с помощью описанных выше фотоактивируемых производных МДП для активированных, но не покоящихся В-клеток, причем рецепторные молекулы находились на клеточной поверхности. Молекулярных характеристик рецепторов приведено не было.

Идентификация рецепторных молекул

Попытки идентифицировать белки, связывающие МДП и более крупные фрагменты пептидогликана, предпринимались неоднократно. Группой Karnovsky опубликованы данные о том, что МДП связывается с серотониновыми рецепторами макрофагов [40], макрофагальной [40] и глиальной клеточных линий [41] и проявляет те же эффекты, что и серотонин: продукцию супероксид-аниона, усиление фагоцитоза и пр. [35, 40]. Связывание было низкоаффинным, в микромолярном диапазоне, а число участков связывания достигало нескольких сотен тысяч, то есть описанные той же группой высокоаффинные мембранные рецепторы МДП на макрофагах не были серотониновыми рецепторами. Неясным остался вопрос, со всеми ли типами серотониновых рецепторов связывается МДП или только с 5-НТ2, который упоминается в одной из работ [34].

Другим типом поверхностных рецепторов, способным связывать и МДП, и более крупные фрагменты пептидогликана, оказался рецептор липополисахарида (эндотоксина) на моноцитах человека - CD14 антиген [51]. Способность CD14 связывать как липополисахарид, так и фрагменты пептидогликана, вызывая активацию клетки, позволили авторам предположить его центральную роль в защите как от грамотрицательных, так и от грамположительных инфекций. Никаких данных о числе рецепторов и аффинности связывания МДП приведено не было. Следует отметить также, что в более ранних работах того же автора (R. Dziarski) отрицалась конкуренция МДП с растворимыми фрагментами пептидогликана за один и тот же рецептор [14].

Хроматографическая и электрофоретическая очистка ГМДП-связывающих белков макрофагов мыши и клеток WEHI-3 позволила нам выделить их в гомогенном состоянии и провести структурный анализ. После триптического гидролиза были получены и проанализированы гомогенные пептиды. Для некоторых были определены аминокислотные последовательности. Сравнение с банком белковых последовательностей позволило идентифицировать ГМДП-связывающие белки рЗ2 и р34 как белки семейства гистонов Н1, а белок 16-20 кД как гистон НЗ [4]. Исследование структурных основ взаимодействия ГМДП с гистонами показало, что для связывания необходим интактный мурамоилпептидный фрагмент. Связывание зонда с гистонами Н1 и НЗ ингибировалось МДП, ГМДП и стеароильным производным ГМДП-Lys, но не дисахаридным или дипептидным фрагментами ГМДП. Важна была и конфигурация изоглутамина, поскольку аналог ГМДП с остатком L-изоглутамина не ингибировал связывание.

Таким образом, одним из типов внутриклеточных МП-связывающих молекул являются гистоны Н1 и НЗ. В пользу функциональной значимости взаимодействия ГМДП с гистонами свидетельствуют [4]:

неспособность биологически неактивного L- ГМДП связываться с гистонами;
способность ГМДП конкурировать с ДНК за связывание гистона Н5 куриных эритроцитов (аналог гистонов Н1 млекопитающих);
усиление в присутствии ГМДП гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой в межнуклеосомных участках, то есть там, где с ДНК связаны гистоны Н1.

Из изложенного выше вытекает, что взаимодействие ГМДП и его аналогов с гистонами должно вызывать ослабление связи последних с ДНК, приводя к изменению структуры хроматина, и повышению доступности регуляторных участков ДНК для факторов транскрипции и РНК-полимераз. Изменения, происходящие под действием ГМДП в структуре хроматина, могут являться одним из путей его влияния на транскрипцию генов, в том числе генов, кодирующих поверхностные антигены макрофагов и опухолевых клеток. В данный момент гистоны могут рассматриваться лишь как потенциальные мишени, поскольку нет прямых данных, свидетельствующих о проникновении ГМДП в клеточное ядро. Следует отметить, что недавно гистоны обнаружены и вне ядра [50] и нельзя исключить взаимодействие ГМДП именно с этими структурами. Также необходимо подчеркнуть, что гистоны — не единственные молекулярные мишени ГМП и поэтому действие ГМП на клетки-мишени в любом случае не ограничивается этим механизмом.

Приведенные выше данные позволяют обосновать следующую схему влияния ГМП на адаптивный иммунитет. Попадая внутрь клетки за счет рецептор-опосредованного или рецептор-независимого эндоцитоза, ГМП взаимодействуют с внутриклеточными мишенями (гистонами Н1 и пр.), активируя биосинтеза белков (мембранных антигенов, цитокинов). В случае клеток макрофагального ряда в результате усиления биосинтеза АГКГ класса II улучшается презентация антигенов Т-хелперам, что в дальнейшем приводит к активации и клеточного, и гуморального звеньев иммунитета. В случае опухолевых клеток индуцированная ГМП экспрессия ОАА, АГКГ и молекул адгезии является отправной точкой для их распознавания как классическими Т-киллерами, так и неспецифическими киллерными клетками.

Предложенный механизм реализуется для МП и ряда ГМДП, и МДП. Между этими семействами нет кардинальных различий в плане механизма действия, хотя между отдельными представителями имеются различия в свойствах. Различия наблюдаются и внутри семейств, что предполагает разнообразные пути воздействия МП на клетки и/или вовлечение в их активность различных клеточных популяций. Действительно, среди МП обнаружены пирогенные и апирогенные аналоги, одни из МП обладают противоопухолевыми свойствами, а другие — нет [9, 25]. То же самое справедливо в отношении противоинфекционной активности. Как уже упоминалось выше, среди большого набора исследованных МП только один, MurNAc-L-Thr-D-iGln-Sn-дипальмитоил-глицерин неспособен активировать ядерный фактор транскрипции NF-KB [37]. Все эти факты предполагают множественность мишеней МП, а также индивидуальный набор мишеней для отдельно взятых МП.

Принимая во внимание вышесказанное, можно заключить, что идентификация рецепторов МП только начинается. Неохарактеризованными остаются высокоаффинные мембранные рецепторы макрофагов и активированных В-лимфоцитов, а также некоторые макрофагальные внутриклеточные МП-связывающие белки. Поэтому, несмотря на заметный прогресс в области изучения молекулярных основ биологической активности мурамилпептидов, работы в этом направлении далеки от завершения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Валякина Т.И., Малахов А.А., Комалева Р.Л. и др. «Дифференциальный эффект гпюкоза- минилмурамилдипептида на фенотип сублиний меланомы, различающихся метастатическим потенциалом.» Мол. биология 30: 1394-1401, 1996.

2. Валякина Т.И., Малахов А.А., Макаров Е.А. и др. «Мурамилпептиды модулируют экспрессию опухолеассоцнированных антигенов.» Иммунология № 4: 32-36,1995.

3. Головина Т.Н., Сумарока М.В., Самохвалова Л.В. и др. «Полипептиды из перитонеальных макрофагов мыши, узнающих гпюкозаминилмурамоил-дипептиды.» Биоорган, химия 21: 268-274,1995.

4. Несмеянов В.А. «Иммуномодуляторы группы мурамилпептидов: на пути к пониманию механизма биологической активности.» В сборнике трудов 1-ой Национальной конференции РААКИ. (Москва) 153-159,1997.

5. Несмеянов В.А., Хайдуков СВ., Комалева Р.Л. и др. «Влияние N-ацетилглюкозаминил-b1--4-N-ацетилмурамоил-аланил-D-изоглутамина на экспрессию Iа-антигенов макрофагами мыши.» Биол. мембраны 6: 245-249,1989.

6. Рахмилевич А.Л., Рахимова В.К., Андронова Т.М., Бовин Н.В. «Иммуностимулирующий эффект мурамилдипептида, глюкозаминилмурамилдипептида и их синтетических производных в системе in vitro.» Антибиотики и химиотерапия 8: 586-588, 1989.

7. Ростовцева Л.И., Андронова Т.М., Малысова В.П., и др. «Синтез и противоопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-(b1--4)-N-ацетилмурамил-дисахаридное звено.» Биоорг. химия 7: 1843-1858,1981.

8. Сорокина И.Б., Малыюва В.П., Ростовцева Л.И. и др. «Поиск противоопухолевых соединений среди природных и синтетических гликопептидов, моделирующих клеточные стенки бактерий.» В кн.: Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей. II Всесоюзное совещание. 147-149, 1982.

9. Andronova Т.М., Ivanov V.T. «The structure and immunomodulating function of glucosaminy-lmuramyl peptides». Sov. Medical Review D. Immunology 4: 1-63,1991.

10. Asano T., McWaters A., An T. et al. «Liposomal muramyl tripeptide upregulates IL-la, IL-lb, TNFα, IL-6 and IL-8 gene expression in human monocytes. » J. Pharmacol. Exp. Ther. 268: 1032-1039,1994.

11. Behbehani K., Beller D.I., Unanue E.R. «The effect of beryllium and other adjuvants on la expression by macrophages. » J. Immunol. 134: 2047-2049,1985.

12. Cohen L.Y., Bahr G.M., Darcissac E.C., Parent M.A. «Modulation of expression of class II МНС and CD40 molecules in murine В cells by various muramyl dipeptides. Cell. Immunol. 169: 75-84,1996.

13. Darcissac E.C., Bahr G.M., Parant M.A. et al. «Selective induction of CD11 a,b,c/CD18 and CD54 expression at the cell surface of human leukocytes by muramyl peptides.» Cell. Immunol. 169: 294-301,1996.

14. Dziarski R. «Demonstration of peptidoglycan-binding sites on lymphocytes and macrophages by photoaffinity cross-linking. » J. Biol. Chem. 266:4713-4718,1991.

15. Ellouz F., Adam., Ciorbaru R., Lederer E. «Minimal structure requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. » Biochem. Biophys. Res. Commun. 59: 1317-1325,1974.

16. Fogler W., Fidler I. «The activation of tumoricidal properties in human blood monocytes by muramyl dipeptide requires specific intracellular interaction. » J. Immunol. 136: 2311-2317,1986.

17. Golovina T.N., Sumaroka M.V., Samokhvalova L.V. et al. «Biochemical characterization of glucosaminyl-muramylpeptide binding sites of murine macrophages. » FEBS Letters 356:9-12,1994.

18. Granelli-Pipemo A., Keane M., SteinmanR.M. «Evidence that cyclosporine inhibits cell-mediated immunity primarily at the level of T-lymphocyte rather that accessory cell. » Transplantation 46: 538-608, 1988.

19. Juy D., Chedid L. «Comparison between macrophage activation and enhancement of nonspecific resistance to tumors by mycobacterial immunoadjuvants. » Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 4105-4109,1975.

20. Kaydalov A., Utkin Yu., Ancronova T. et al. «Muramyl peptides bind specifically to rat brain membranes. » FEBS Lett. 248: 78-82,1989.

21. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Nesmeyanov V.A. «N-Acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages. » Int. J. Immunopharmol. 17: 903-911,1995.

22. Kotani S., Watanabe Y., Kinoshita F., et al. «Immunoadjuvant activities of synthetic N-acetylm- uramyl peptides or amino acids. » Biken J. 18: 105-112,1975.

23. LeClerc C., Chedid L. «Are there receptors for MDP at the macrophage surface. » Int. J. Immunotherapy. 11: 109-114,1986.

24. Lederer E. «Immunomodulation by muramylpeptides: recent developments. » Clin. Immun. Newslett. 3: 83-86,1982.

25. Lederer E. «Natural and synthetic immunomodulators derived from the mycobacterial cell wall. » In: Advances in Immunomodulation (Eds. Bizzini B., Bonmassar E.) (Roma-Milan: Pythagora Press) 9-36,1988.

26. Leclerk C., Bahr G.M., Chedid L. «Marked enhancement of macrophage activation induced by synthetic muramyl dipeptide (MDP) conjugate using monoclonal anti-MDP antibodies. » Cell. Immunol. 86: 269-277, 1984.

27. Maeda M., Knowles R.D., Kleinerman E.S. «Muramyltripeptide phosphatidylethanolamine (MTP-PE) encapsulated in liposomes stimulates monocyte production of tumor necrosis factor and interleukin-1 in vivo. » Cancer Commun. 3: 313-321, 1991.

28. Morin C., Barratt G., Fessi H. «Improved intracellular delivery of a muramyl dipeptide analog by means of nanocapsules. » Int. J. Immunopharmacol. 16: 451-456,1994.

29. Nesmeyanov V. A., Golovina T.N., Khaidukov S.V., Shebzuchov Yu.V. «Muramyl-peptide-bin- ding proteins of macrophages: identification and characterization. » In Peptides in Immunology (Ed. C.H. Schneider) (John Wiley & Sons) 291-294,1996.

30. Nesmeyanov V. A., Golovina T.V., Valyakina T.I. et al. «Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides. » In «Immunotherapy of Infections» (Ed. Noel Masihi)

(New York-Basel-Hong Kong: Marcel Dekker, Inc.) 213-223,1994.

31. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L. et al. «Muramylpeptides augment express- ionofla-antigens on mouse macrophages. » Biomed. Sci. 1: 151-154, 1990.

32. Petit C., Monsigni M., Roche A.-C. «Macrophage activation by muramyl dipeptide bound to neoglycoproteins and glycosylated polymers: cytotoxic factor production. » J. Biol. Resp. Mod. 9: 33-43,1990.

33. Pinegin B.V., Kulakov A.V., Makarov E.A., Ledger P.W. et al. «The occurrence of natural ant-ibodies to minimal component of bacterial cell wall (N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl dipeptide) in sera from healthy humans. » Immunol. Letters. 47: 33-37, 1995.

34. Polanski M., Kamovsky M.L. «Serotonergic aspects of the response of human platelets to immune-adjuvant muramyl dipeptide. » J. Neuroimmun. 37: 149-160, 1992.

35. Polanski M., Vermeulen M.W., Wu J., Kamovsky M.L. «Muramyl dipeptide mimicry in the regulation of murine macrophage activation by serotonin. » Int. J. Immunopharmacol. 17:225-232,1995.

36. Richerson H.B., Adams P.A., Iwai Y., Barfknecht C.F. «Uptake of muramyl dipeptide fluorescent congeners by normal rabbit bronchoalveolar lavage cells: a study using flow cytometry. » Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2: 171-181,1990.

37. Schreck R., Bevec D., Ducor P. et al: «Selection of muramyl peptide based on its lack of activation of nuclear factor-кВ as potential for AIDS vaccines. » Clin. Exp. Immunol 90: 188-193,1992.

38. Shimada S., Caughman S.W., Sharrow S.O. et al. «Enhanced antigen-presenting capacity of coultured Langerhans’ cells is associated with markedly increased expression of la antigen. » J. Immunol. 139: 2551-2555,1987.

39. Silverman D., Krueger J., Kamovsky M. «Specific bindingsites for muramyl peptides on murine macrophages. » J. Immunol. 136:2195-2201,1986.

40. Silverman D., Wu H., Kamovsky M. «Muramyl peptides and serotonin interact at specific binding sites on macrophages and enhance superoxide release. » Biochem. Biophys. Res.Commun. 131: 1160-1167,1985.

41. Silverman D.H.S, Imam K., Kamovsky M.L. «Muramylpeptide/serotonin receptors in brain- derived preparations. » Peptide Res. 2: 338-344,1989.

42. Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V. et al. «Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. » FEBS Letters 295:48-50,1991.

43. Tabata Y., Ikada Y. «Macrophage activation for antitumour function by muramyl dipeptide-protein conjugates. » J. Pharm. Pharmacol. 42: 13-19, 1990.

44. Tanaka A., Nagao S., Saito R. et al. «Correlatrion of stereochemically specific structure in muramyl dipeptide between macrophage activation and adjuvant activity. » Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 621-627,1977.

45. Tenu J.-P., Adam A., Souvannavong V. et al. «Photoafifinity labelling of macrophages and B-lymphocytes using 1251- labelled arylazide derivatives of muramyldipeptide. » Int. J. Immunopharmacol. 11: 653-661, 1989.

46. Tenu J.-P., Roche, A.-C, Yapo, et al. «Absence of cell surface receptors for muramylpeptides in mouse peritoneal macrophages. » Biol. Cell 44: 157-164,1982.

47. Valyakina T, Malakhov A., Malakhova N. et al. «Glucosaminylmuramyldipeptide-induced changes in phenotype of melanoma cells result in their increased lysis by peripheral blood cells». Int. J. Oncol. 9: 885-891,1996.

48. Valyakina T.I, Komaleva R.L., Petrova E.E. et al. «Endogenous tumour necrosis factor-alpha sensitise melanoma cells to glucosaminylmuramyl dipeptide. » FEBS Letters (submitted).

49. Vermeulen М., Gray G. «Proceeding of Bacillus Subtilus peptidoglycan by a mouse macrophage cell line. » Infection and Immunity 46: 476-483, 1984.

50. Watson K., Edwards R. J., Shaunak S. et al. «Extra-nuclear location of histones in activated human peripheral blood lymphocytes and cultured Т-cells. » Biochem. Pharmacol. 50:299-309,1995.

51. Weidemann В., Schletter J., Dziarski R. et al. «Specific binding of soluble peptidoglycan and muramyldipeptide to CD14 on human monocytes. » Infect. Immun. 65: 858-864, 1997.

52. Yamaguchi F., Akasaki M., Tsukada W. «Induction of colony-stimulating factor and stimulation of stem cell proliferation by injection of muroctasin. » Arzneim. Forsch/DrugRes. 38(II): 980-983, 1988.

53. Yoo Y.C., Saiki I., Sato K„ Azuma I. «MDP-Lys(L18), a lipophylic derivative of muramyl dipeptide, inhibits the metastasis of haematogenous and non-haematogenous tumours in mice. » Vaccine 12: 175-180, 1994.

Abstract

Glucosaminylmuramylpeptides: the state of play in studying the molecular mechanism of biological activity

VA. Nesmeyanov

Shemyakin-Ovchinmkov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russia

Muramyl peptides (MPs), discovered in early 70s by E. Lederer, are recognized as potent immunomodulators and perspective medicines. Despite numerous publications dealing with MPs structure, synthesis, biological activities and clinical studies the molecular mechanism of their action remains poorly understood. In this paper the data obtained during the last decade upon study of the subgroup of MPs, glucosaminylmuramyl peptides (GMPs), are summarized and compared with data on other muramyl peptides.

The study of mechanism of GMPs adjuvant activity demonstrated that along with the ability to induce synthesis of various cytokines by macrophages, characteristic for other MPs as well, GMPs were capable of augmenting MHC class II expression on macrophages. This effect correlated with adjuvant activity of GMPs assuming that they influence adjuvant activity by improving antigen presentation to T-helper cells. The augmented expression of adhesion molecules upon action of MPs on monocytes reported by others might also contribute to this process.

Upon study of anti-tumor activity of GMPs it was observed that not only macrophages but tumor cells as well were able to respond to GMPs by increasing expression of cell surface antigens. The expression of tumor-associated antigens and certain adhesion molecules was shown to be affected. The GMP-induced alteration in antigen expression resulted in increased lysis of tumor cells by immune cytotoxic cells as was demonstrated for human melanoma. Hence, the anti-tumor activity of GMPs has to be attributed not only to direct activation of cytotoxic macrophages reported earlier, but in addition to changes in the spectrum of target cells surface antigens making them more susceptible to lysis.

Data collected by our and other laboratories prove that the effect of MPs on macrophages was mediated by interaction with receptor molecules located on plasma membrane and inside cells. Internal GMP-binding sites were found besides macrophages in T-helper and tumor cells. A number of receptor proteins for GMPs were present inside murine macrophages. Among proteins capable of specific binding of MPs histones HI were identified. The interaction of GMPs with chromatin was shown to result in altered chromatin structure proved by increased hydrolysis of GMP-treated chromatin by micrococcal nuclease. Based on these data the hypothesis was formulated postulating that MPs affect gene expression by competing with DNA for histones and making DNA regulatory sequences accessible for polymerases and transcription factors.

Key words: muramyl peptides, tumor, chromatin.